多酶恒溫快速擴(kuò)增技術(shù)在大動物分子診斷領(lǐng)域的應(yīng)用

　　如何將傳統(tǒng)分子檢測方法變的更加簡單易懂、操作方便和快速精準(zhǔn)。一直是分子檢測行業(yè)的一大課題。各個廠家和科研院所都在這方面投入了大量的時間和金錢。

　　在熒光檢測領(lǐng)域，MIRA技術(shù)將60分鐘以上的核酸擴(kuò)增階段，縮短到20分鐘。其開發(fā)了“核酸膠體金試紙條檢測法”，可*拋棄掉高昂的檢測設(shè)備，僅需配備簡單的溫控儀器即可（如金屬浴、水浴鍋等），甚至42°溫水和利用人體溫度亦可完成擴(kuò)增反應(yīng)，且核酸擴(kuò)增時間進(jìn)一步縮短到10分鐘不到。其結(jié)果的準(zhǔn)確率與傳統(tǒng)PCR檢測方式準(zhǔn)確率一致。

　　具體操作方法如下：

　　1.采用我司自主開發(fā)的快速核酸擴(kuò)增試劑提取核酸（核酸提取劑與樣本混勻，室溫靜置5分鐘即可取上清作為核酸模板），或者采用市場常見“離心柱法”和“磁珠法”提取核酸作為模板亦可；

　　2.取上述模板2μL加入到復(fù)融后的反應(yīng)液中，通過上述各種加熱手段，保證加熱溫度在37°~42°之間10分鐘即可。

　　3.上述反應(yīng)時間結(jié)束后，向反應(yīng)液中加入少許無菌水稀釋，后直接插入試紙條，則馬上可通過試紙條上的條帶顏色變化，從而判定陰陽性。

　　自主研發(fā)用時，引物設(shè)計(jì)注意事項(xiàng)：

　　核酸試紙條三明治夾心檢驗(yàn)法探針設(shè)計(jì)：在上下游引物中間設(shè)計(jì)一條長度為46-52nt與目的片段互補(bǔ)序列；5’端修飾一個抗原標(biāo)記（典型FAM）;5’端和3’端中間位置標(biāo)記一個dSpacer(THF)；3’端標(biāo)記一個修飾基團(tuán)，如胺基、生物素或C3-Spacer，同時要求下游引物5’端標(biāo)記一個修飾基團(tuán)。

　　該方法極其適用于現(xiàn)場核酸提取。可應(yīng)用于傳染病初篩、食品安全、寵物疾病檢測、活體市場抽檢等各種不具備完整分子檢測條件下的核酸測試。對操作人員專業(yè)水平要求低，檢測結(jié)果可信度高。